8 Kasım 2020 Pazar

COVID19 Genetik Testleri

Real- Time PCR: 

    COVID-19 taraması için ilk tercih edilen test yöntemi revers transkripsiyon–polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile viral nükleik asit tayinidir (Li et al. 2020). RNA eldesi üst solunum yolları (orofarinks ve nazofarinks) sürüntülerinden yapılabileceği gibi bronkoalveolar lavaj ve balgam gibi alt solunum yolu örnekleri de RNA eldesi için kullanılabilir. Nazofarinksten alınan örneklerin orofarinksten alınan örneklere göre iki kat daha iyi sonuç verdiği görülmüştür.(W. Wang et al. 2020) Her iki örneğin alınması durumunda, örneklerin ortak bir tüpte birleştirilmesi önerilmekte; en iyi sonucun hem alt hem de üst solunum yollarının ortak test edilmesiyle elde edileceği bilinmektedir.(Loeffelholz and Tang 2020). SARS-CoV2 RNA’sı dışkı, idrar ve kan örneklerinden de izole edilebilmiştir ancak bu örnekler solunum örneklerinden daha az güvenilirdir. Üst solunum yolu örneklerinin semptomların başlangıcından itibaren birkaç gün içinde toplanması önerilmektedir (Loeffelholz and Tang 2020). Virüsün üst solunum yollarında ilk hafta sonunda, daha ağır vakalarda alt solunum yollarında 3 ve 4. haftaların sonunda pik yaptığı bildirilmiştir. (Loeffelholz and Tang 2020) RT -PCR testinin SARS-CoV2 dışında çapraz reaksiyonla başka bir virüsü tespit etmediği bilinmektedir ve bu nedenle özgünlüğü oldukça yüksek bir testtir. Duyarlılığı için kesin bir oran verilememekle birlikte ortalama %63-78 arasında değiştiği bildirilmiştir (Zitek 2020). Viral yükün az olması ya da yer değiştirmesi, yanlış örnekleme, erken ya da geç örnek alımı, testten önce antiviral kullanımı, transport hatası, ortamda PCR inhibitörlerinin varlığı, viral genetik mutasyon gibi nedenlerle yanlış negatiflikler sık görülmektedir. Testin negatif çıkması durumunda aralıklarla tekrarlanması testin duyarlılığını arttırmak için önerilmektedir (Loeffelholz and Tang 2020)(Zitek 2020)(Fang et al. 2020)(Hong et al. 2020). Hastaların klinik bulgularının RT-PCR sonuçlarıyla birlikte değerlendirilmesi büyük öneme sahiptir. Örneğin; pandeminin başladığı şehir olan Wuhan’da yapılan 4880 vakalık bir çalışmada RT-PCR’nin tanı yüzdesinin ateş bulgusu varlığında %19 oranında yükseldiği, ayrıca ileri yaş ve erkek vakalarda testin tanısal değerinin arttığı bildirilmiştir (Liu et al. 2020). Yine Çin’de yapılan 82 vakalık klinik bir gözlemde, bilgisayarlı tomografi (BT) ile birlikte değerlendirildiğinde RT-PCR’nin duyarlılığının %79’dan %94’e yükseldiği tespit edilmiş olup bu durum akciğer tutulumunun varlığının diğer klinik bulgular gibi RT-PCR’de yanlış negatiflik oranlarını düşürdüğünü göstermektedir (He et al. 2020). RT-PCR, kısıtlılıklara rağmen COVID-19 enfeksiyonlarının doğrulanmasında uygulanan altın standart bir yöntemdir (Loeffelholz and Tang 2020). Virüse ait RNA’nın hedeflenen bölgelerinde yer alan nükleotid dizilerinin amplifikasyonunun gerçek zamanlı olarak floresan boyalarla görünür hale gelmesini sağlar (Kubista et al. 2006). Hedef bölge olarak sıklıkla S (spike) ve N (nükleokapsit) genleri ve yapısal olmayan RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) ve ORF 1a/b (replicase open reading frame) genleri evrimsel süreçte korunmuş, eksprese olan ve çapraz reaksiyona en az giren genler oldukları için kullanılmaktadırlar (Chan et al. 2015)(Lu et al. 2020). SARS-COV2’ye ait RdRp/Hel bölgesinin tanısal değeri RdRp-P2 bölgesiyle karşılaştırıldığında duyarlılığının ve özgünlüğünün daha yüksek olduğu saptanmıştır (Chan et al. 2020). Farklı test kitlerinde çeşitli sayıda farklı gen bölgeleri kullanılmakta ve bu gen bölgelerine uygun RT-PCR protokolleri uygulanmaktadır. Örnek eldesi ve taşınmasında uluslararası viral transport mediumları kullanılabileceği gibi kite özgü viral nükleik asit tamponları da kullanılabilmektedir. Alınan örnekler tercihen 4 ℃’de ve en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalıdır (Hong et al. 2020). PCR sonunda değerlendirilebilir hale gelen hedef genlerin eşik döngü değerinin (Threshold cycle/ Ct) sınır değerin altında olması viral nükleik asit varlığının göstergesi olup pozitif sonuç anlamına gelmektedir. Test ortalama birkaç saat içinde sonuçlanmaktadır (Hong et al. 2020). Reaktif reaksiyon koşulları, analiz edilen gen sayısı analizin hassasiyetini etkileyebilmektedir. PCR koşullarının laboratuvar tarafından optimizasyonu önemlidir. Klinik laboratuvarın rutin çalışmada, onaylanmış negatif ve pozitif numuneleri kullanarak kalite kontrolü yapması gereklidir (H. Wang et al. 2020). Tüm bunların dışında testi yapılan patojen, bir RNA virüsüdür ve RNA, stabilitesi düşük, hücre yıkımından sonra birçok enzim tarafından kolayca yıkılabilen, kontaminasyon riski yüksek bir moleküldür. Ayrıca RNA virüslerinin mutasyona yatkınlığının yüksek oranda olduğu da bilinmektedir. Dolayısıyla; testin özgünlüğünü yüksek oranda etkileyebilecek bir diğer neden de test çalışmasının bir RNA virüsü üzerinde yapılmasıdır (H. Wang et al. 2020). Sonuç olarak; real-Time PCR, COVID19 tanısında ilk başvurulan test olmasına rağmen, yanlış negatiflik oranları nedeniyle izolasyon ve tedavi kararı verilirken tek başına değerlendirilmemelidir. Hasta multidisipliner bir yaklaşımla ele alınmalı; klinik bulgular, akciğer BT vb. diğer tüm verilerle birlikte değerlendirilmelidir (Tahamtan and Ardebili 2020). 

Dizi Analizi: 

    Virüs genomu 26-32 kb arasında değişmekte olup, 14 ORFs (open reading frames) bölgesi içermektedir ve 26 protein kodlamaktadır. Spike yüzey glikoproteini (S), zarf proteini (E), matriks proteini (M), nukleokapsid proteini (N) temel proteinleridir (H. Wang et al. 2020). Virüse ait genom bilgisinin dizilenmesi ile daha önce bilinen SARS-CoV (%79) ve MERS-CoV (%50) benzerliği ortaya konmuştur. SARS-CoV2’nin ORF1a ve S genindeki farklılıklar dışında SARS-CoV’a yüksek oranda homoloji gösterdiği görülmüştür. Filogenetik çalışmalarda değerlendirilen RNA dizisi virüsün Beta-coronavirüs ailesine ait olduğu bildirilmiştir.(Xu et al. 2020) Böylelikle virüsün kaynağı, evrimi, kullandığı mekanizmalar, bulaş yolları, tedavi gibi birçok bilgi hakkında öngörüde bulunulabilmiştir. Spike proteinini kodlayan S genindeki benzerlik ve farklılıklar virusun insan ACE2 reseptörlerine bağlanması ve insandan insana bulaşı hakkında önemli ipuçları vermiştir. SARS-CoV2’nin atasının yarasa korona virüsü HKU9-1 (%87) olduğu tespit edilmiştir.(Xu et al. 2020)(H. Wang et al. 2020) Elde edilen dizinin protein modelleme çalışmaları yapılarak S proteinin ACE2 reseptörlerine yüksek oranda afinite gösterdiği bildirilmiştir.(Xu et al. 2020) İnsandan insana bulaşma dinamikleri, bağışıklık yanıtı, viral replikasyon hızı ve virüs mutasyon hızı gibi verilerin eldesi virüs genomunun tespiti ile sağlanmıştır (Xu et al. 2020)(H. Wang et al. 2020). Yapılan başka bir çalışmada dünyanın farklı ülkelerinden elde edilen 10 adet SARS-CoV2 dizisi karşılaştırılmış; M ve N proteinlerini kodlayan dizilerde herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. S protein dizisinde iki aminoasit varyantı, bir örnekte ise E proteininde bir adet mutasyon, ORF1ab ve ORF8 bölgelerinde ise iki olası SNP (single nükleotid polimorfizm) saptanmıştır.(Chang et al. 2020) Virüsün RNA dizisine ait benzeri çalışmalar, pandeminin seyri, hastalığın profilaksisi ve tedavisi açısından oldukça değerlidir (Chang et al. 2020). SARS-CoV2’nin genom dizilenmesi virüse karşı geliştirilebilecek aşı teknolojilerinin de önünü açmıştır. Özellikle DNA ve mRNA üzerinde diğer viral patojenlerle ilgili yapılmış aşı çalışmaları SARS-CoV2 çalışmalarının önünü açmıştır.(Prompetchara, Ketloy, and Palaga 2020) ACE-Fc proteinin dizisinin tedavi için yapılacak çalışmalarda aday gen olduğu bildirilmiştir (Prompetchara et al. 2020) (Schweickert et al. 2009)(Kruse 2020).

DÜNYA PANDEMİ YAŞIYOR


COVID19 Yatkınlık Testi, IRF7, TLR3